Microrganismos Endofíticos

AUTOR: Rafaela Mazur Bizi

INTRODUÇÃO

A necessidade da redução do consumo de agroquímicos, em especial aqueles que causam danos ao meio ambiente, às comunidades microbiológicas e ao homem, tem aumentado o interesse por estratégias de controle biológico de pragas e doenças de inúmeras espécies cultivadas. Este controle biológico pode ser feito alterando as condições ambientais que dificultam o aparecimento da praga ou doença, ou utilizando inimigos naturais do patógeno ou praga alvo. No Brasil o controle biológico com microrganismos começou a ser utilizado com o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e com o Baculovírus, no controle das cigarrinhas da cana e das pastagens e no controle da Anticarsia gematalis na soja, respectivamente. Atualmente, o fungo Trichoderma tem sido utilizado para o controle do fungo Crinipellis perniciosa , agente causal da vassoura de bruxa do cacaueiro.

A teoria da associação benéfica ou neutra entre microrganismos e plantas se iniciou com o trabalho de Perotti (1926). Entretanto, o conhecimento de microrganismos em tecidos vegetais assintomáticos iniciou-se antes de 1870 com Pasteur (revisado por Smith, 1911 e citado por Hallmann et al ., 1997). Neste contexto, foi definido que endófitos são aqueles microrganismos que habitam o interior de tecidos vegetais sem causar aparentemente nenhum dano ao seu hospedeiro.

Com o acúmulo de informações a respeito da interação entre endófitos e a planta hospedeira, e com os resultados promissores obtidos, tem sido verificada uma atenção especial ao estudo de microrganismos endofíticos como agentes de controle biológico de inúmeras doenças, como promotores de crescimento vegetal e no controle de pragas. Estudos recentes têm demonstrado que microrganismos considerados presentes somente na risosfera podem também colonizar endofiticamente a planta, onde também são ativos na promoção de crescimento e no controle de patógenos e pragas.

Microrganismos endofíticos colonizam os espaços intercelulares dos tecidos vegetais, sem causar quaisquer danos a estes. Desta forma, este nicho ecológico ocupado pelos endófitos, os favorecem para o controle biológico de patógenos e pragas, pois neste local poderiam competir por nutrientes e espaço com os patógenos, bem como produzir substâncias tóxicas a estes organismos ou ainda, induzir a planta a desenvolver resistência às doenças.

Estudos anteriores têm mostrado que pelo menos 15 gêneros de bactérias são capazes de controlar doenças fúngicas ou bacterianas em culturas de interesse, destes, os gêneros Bacillus e Pseudomonas apresentam um maior potencial para o controle efetivo de doenças. No caso de fungos endofíticos, os gêneros Neotyphodium (sin. Acremonium) e Fusarium apresentam maior potencial para o controle biológico de doenças e principalmente de insetos.

Os endófitos são transmitidos via sementes, por meio da reprodução de plantas por estaquias contaminadas. Ou penetrando ativa ou passivamente via as raízes e estômatos. Após a penetração e estabelecimento, os microrganismos endofíticos podem colonizar regiões específicas dos tecidos do hospedeiro ou se disseminarem de forma sistêmica pelos vasos condutores ou espaços intercelulares. Neste caso, para fungos a colonização sistêmica depende da formação de estruturas leveduriformes que possibilitem esta disseminação.

MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS NO CONTROLE BIOLÓGICO

Embora alguns produtos, como os inseticidas e fungicidas, visem respectivamente ao controle de pragas e fungos fitopatogênicos, eles também são responsáveis pela eliminação de espécies úteis, como insetos controladores de pragas e microrganismos que estão desempenhando um importante papel no ambiente, controlando o crescimento e a multiplicação de outros microrganismos que, devido aos desequilíbrios surgidos, tornam-se patógenos. Um dos grupos de microrganismos afetados por essas modificações antropogênicas é o dos endofíticos, incluindo aí, principalmente fungos e bactérias.

As interações entre as plantas e microrganismos já são conhecidas há muito tempo. Entretanto, com exceção da associação de plantas com fungos micorrízicos diazotróficos da rizosfera, acreditava-se que estas interações levavam à formação de lesões nos tecidos vegetais. Mais recentemente vem sendo registrada a presença de microrganismos no interior de tecidos vegetais sadios, abrindo novas perspectivas para o estudo da interação planta/microrganismo.

Microrganismos endofíticos, geralmente fungos e bactérias, são combinações de microrganismos e plantas que vivem sistematicamente no interior das plantas, sem causar aparentemente dano a seus hospedeiros. São distintos dos microrganismos epifíticos, que vivem na superfície dos órgãos e tecidos vegetais .

Microrganismos endofíticos também podem ser encontrados não apenas nas partes aéreas dos vegetais, mas inclusive em raízes, que são, aliás uma das principais portas de entrada.

Entretanto, fungos micorrízicos distinguem-se de outros microrganismos endofíticos de raízes, pois estes últimos não possuem estruturas externas, como por exemplo hifas. Também bactérias endofíticas de raízes distinguem-se das simbiontes fixadoras de nitrogênio, como Rhizobium, que formam estruturas externas designadas de nódulos.

Através de análises ecológicas de uma gama de espécies hospedeiras, fica aparente que fungos endofíticos compreendem um nicho e complexo ecológico distinto de parasitas obrigatórios saprófitas

Colonizando o interior da planta hospedeira, os microrganismos endofíticos podem competir por espaço e nutrientes com os patógenos, reduzindo dessa forma o aparecimento de doenças. As doenças causadas pelo fungo Rhizoctonia solani em batata ( Solanum tuberosum ), tem sido as mais estudadas para o controle por microrganismos endofíticos. No Brasil, a cultura do repolho tem recebido especial atenção e resultados promissores têm sido obtidos no controle de Xanthomonas campestris pelas bactérias endofíticas Alcaligenes piechaudii e Kluyvera ascorbata . Neste aspecto, a indução de resistência sistêmica por fungos e bactérias endofíticas parece ser o mecanismo mais importante para controle biológico de doenças, embora a produção de compostos antagônicos também possa estar envolvida.

A indução de resistência esta associada à alterações bioquímicas e estruturais na planta hospedeira. Neste tipo de controle, a penetração ativa do microrganismo endofítico pode induzir a planta a sintetizar compostos que atuam sobre o patógeno ou alterar a morfologia vegetal, as quais podem incluir o aumento da parede celular do hospedeiro e a síntese de fitoalexinas, afetando adversamente o crescimento e desenvolvimento do patógeno.

Em outras observações, surge a constatação de que alterações do ambiente podem afetar a produção de toxinas pelos fungos endofíticos. Breen (1992) verificou que alterações na temperatura e mudanças de estação modificam as concentrações de toxinas nas plantas, como é o caso da peramina produzida em L. perenne, infectado com A. lolii. Dessa maneira, como a antixenose em relação ao afídio S. graminum é dependente de peramina e da concentração de endófitos, uma decorrência natural é de que também se alterem os efeitos sobre o inseto-praga. A existência de especificidades entre certos fungos endofíticos e plantas hospedeiras fizeram com que Leuchtmann (1992) sugerisse um estudo mais aprofundado da ocorrência de raças fisiológicas em fungos endofíticos que seriam importantes em futuros estudos visando a um controle biológico de insetos, utilizando endófitos.

A expressão da resistência aos insetos pode ser afetada por diversos fatores, como quantidade dos aleloquímicos presentes, genótipo da planta, concentração de microrganismos endofíticos, fertilidade do solo e genótipo dos endófitos. Falta de água, temperatura, pH do solo, resistência dos insetos-praga e outros fatores podem afetar também a quantidade de endófitos e a concentração de toxinas.

Em milho foi observado que em plântulas provenientes de sementes inoculadas com uma linhagem endofítica de Fusarium moniliforme, ocorreu uma maior deposição de lignina nas raízes, sugerindo que esta característica pode conferir maior resistência contra patógenos.

Foi observado que em algumas formas de resistência a doenças, a planta deve apresentar uma predisposição a ser colonizada por endófitos específicos, os quais poderiam conferir este caráter, sugerindo a necessidade da introdução destes fungos e bactérias endofíticas em programas de melhoramento genético de diferentes espécies vegetais, visto que esta interação poderia ser melhorada com genótipos mais susceptíveis a estes endófitos.

Várias espécies de fungos endofíticos são conhecidos por serem taxonomicamente relacionados a patógenos virulentos dos mesmos hospedeiros relacionados e podem refletir recente especiação. Em pinheiros, o endófito Lophodermium pinastri e L. conigenum pertencem ao mesmo gênero do patógeno L. seditiossum.

OCORRÊNCIA DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS ENDOFÍTICOS E SUA INOCULAÇÃO EM PLANTAS

Como fungos endofíticos, principalmente os do gênero Acremonium, são controladores de alguns insetos-praga, é importante saber se eles podem ser inoculados em plantas livres de endófitos e transmitir a elas a capacidade de se tornarem resistentes a certas pragas. Foi o que fizeram com sucesso Koga et al. (1997), transferindo o endófito Acremonium para F. arundinacea e L. perenne. Conseguiram, assim, transmitir via semente a capacidade dessas plantas controlatem o inseto P. teterrella.

Da mesma forma, Pereira et al. (1999) em bananeira, inocularam artificialmente fungos endofíticos com marcadores genéticos de resistência a determinados fungicidas e verificaram que não apenas a inoculação era eficiente, como também os fungos foram mantidos em competição com outros não-mutados. Isso demonstra que a inoculação de linhagens de valor no controle biológico poderá não apenas ser praticada com sucesso, mas que o microrganismo modificado, uma vez inoculado, mantém-se no hospedeiro, podendo coexisistir e até superar linhagens selvagens da mesma espécie.

Um ponto importante, pelo menos em gramíneas, reside no fato de que várias espécies de fungos podem ser transferidas por meio de sementes, o que torna o biocontrole praticamente “hereditário”, capaz de passar para os descendentes.

 FUNGOS ENDOFÍTICOS

 Fungos endofíticos atende-se a designar as espécies de fungos que habitam os tecidos internos e sub-cuticulares de uma planta, por pelo menos parte do ciclo de vida. Nem endófitos, nem epífitos apresentam haustórios, estrutura comum em fungos patogênicos. Em geral, as infecções por fungos endofíticos não produzem sintomas externos, podendo estar latentes ou serem assintomáticos.

A infecção por fungos endofíticos adiciona ao repertório de defesas constitutivas e induzidas a presença de uma micotoxina, cuja natureza é de alcalóides ou de compostos fenólicos. A própria presença do fungo poderia atuar sinergicamente para alterar o fenótipo da planta e acionar as defesas acima mencionadas. A presença de patógenos pode alterar a temperatura da planta e alterar o padrão de escolha de plantas por insetos para oviposição e herbivoria. A infecção microbiana causa perda prematura de folhas, resultando no aumento na taxa de mortalidade de insetos minadores de folhas (os quais possuem hábitos sedentários). Estes autores sugerem ainda que inimigos naturais de insetos herbívoros podem ser atraídos por metabólicos fúngicos para o local onde está ocorrendo herbivoria.

Fungos endofíticos podem também influenciar na dispersão da planta hospedeira. De acordo com McCaffrey et al. (1991) e Wolock & Clay (1991), fungos transmitidos por semente podem ter papel fundamental na dispersão diferencial de uma planta e, portanto, no seu padrão de distribuição. Formigas e pássaros parecem ter preferência por sementes não infectadas.

Este padrão corrobora a hipótese de que plantas cuja infecção também ocorre na porção reprodutiva tendem a possuir um crescimento vegetativo mais vigoroso, como se percebe nas plantas infectadas. O vigor, a produção de compostos secundários, o crescimento modular, a arquitetura, a abscisão de folhas, a temperatura e o estresse das plantas hospedeiras são de crucial relevância nos mecanismos de resistência e susceptibilidade a herbívoros, principalmente insetos galhadores.

Especificamente em Baccharis (Asteraceae), uma espécie de fungo endófito, Ceratopycnidiium baccharidicola, foi descrito recentemente colonizando B. coridifolia no Brasil, uma espécie tóxica ao gado. Em B. concinna foram identificadas, até o presente momento, 8 espécies associadas: Cladosporium cladosporioides, Penicillium rugulosum, Penicillium sp., 2 espécies da classe Coelomycetes e 3 espécies de fungos não esporulados. Todavia, ainda não conhecemos sua dinâmica temporal e espacial, seu padrão de produção de toxinas e a influência na comunidade de herbívoros associados.

Apesar de devidamente comprovada a existência da microbiota endofítica, muitas pesquisas ainda deverão ser feitas a respeito de aspectos ecológicos, genéticos e fisiológicos dessa interação. Antes disso, é interessante se conhecer a diversidade desses organismos, sua presença, freqüência e funções. Existe uma série de razões para que se aprofundem os estudos com endofíticos. Primeiro, a falta de informações para elucidar a base biológica dessas interações. Segundo, porque os endofíticos são vantajosos, pois muitos benefícios para a planta têm sido atribuído à presença deles:

a) vários endofíticos são capazes de produzir antibióticos e outros metabólicos secundários de interesse farmacológico;

b) podem servir como bioindicadores de vitalidade (Helander & Rantio-Lehtimaki, 1990);

c) têm sido usados como agentes de controle biológico de pragas e doenças;

d) têm sido usados como bioherbicidas;

e) podem ser usados na biorremediação de solos contaminados com poluentes, e

f) são usados como vetores para introdução de genes em plantas hospedeiras.

ENDÓFITOS NÃO ATUANDO NA REDUÇÃO DE ATAQUE

DE INSETOS EM SEUS HOSPEDEIROS

A presença de endófitos, mesmo os que comprovadamente já demonstraram atuar no controle de pragas, nem sempre resulta em um controle efetivo. Em carvalho, estudos realizados durante um período de quatro anos mostraram que existem diferenças sazonais com relação à presença de endófitos. Nesse caso, a incidência do lepidóptero Cameraria sp., um minador de folhas, não foi alterada pelo endófito e até em alguns casos houve maior incidência da praga coincidindo com o aumento de endófitos, sugerindo que os insetos minadores de folhas facilitam a instalação e o incremento de fungos endofíticos. Também não houve qualquer preferência de ovoposição por parte de fêmeas do inseto, que colocaram ovos igualmente em folhas com ou sem o fungo.

PRODUÇÃO DE TOXINAS POR MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS

Desde os trabalhos pioneiros na área, a capacidade dos endófitos em repelir insetos ou causar redução de peso, crescimento, desenvolvimento e mesmo mortalidade de pragas, foi relacionada à produção de toxinas por determinados fungos endofíticos. Em vários desses casos, foi verificado que o modo de atuação de certos fungos endofíticos no controle era tornar a planta menos palatável a vários tipos de pragas, como afídeos, grilos, besouros, etc. Atualmente, é conhecido o fato de que várias toxinas são produzidas por fungos endofíticos e são elas que protegem a planta contra herbívoros, sejam eles mamíferos, insetos ou outros animais.

Até o presente, a maioria das toxinas identificadas pertence ao grupo dos alcalóides, incluindo ergopeptina, lolitrem indolisoprenóide, pirrolizidina e pirrolopirazina. Entre estas, as toxinas produzidas pelo fungo Neotyphodium sp. são as mais importantes, pois este endófitos coloniza inúmeras espécies utilizadas como pastagens e as toxinas por ele sintetizadas apresentam intenso efeito sobre os animais.

A toxina Lolitrem B ataca o sistema nervoso central, causando dificuldade de andar e reações involuntárias no animal que a ingere, enquanto a Ergovalina é um vaso constritor, que pode causar alterações na temperatura corpórea e redução dos níveis de prolactina dos animais. Além disso, estas duas moléculas podem interagir aumentando os efeitos sobre o sistema nervoso central. A Peramina torna a planta hospedeira menos atrativa para insetos, tornando a menos atacadas por pragas.

Compostos não alcalóides produzidos por Epichloë typhina em Phleum pratense aumentam a resistência da planta hospedeira contra Cladosporium phlei . Estes compostos incluem sesquiterpenóides, ácidos graxos e fenólicos, mostrando que diferentes compostos produzidos por endófitos podem atuar sobre a planta hospedeira ou diretamente sobre o patógeno.

Outro exemplo é o caso do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana , o qual pode colonizar plantas de milho, apresentando a capacidade de habitar tecidos vasculares da planta hospedeira. Nestas plantas, quando a broca do colmo do milho ataca plantas colonizadas por B. bassiana , a infecção é reduzida, pois o fungo endofítico protege a planta contra esta larva. Para isso, os esporos ou hifas do fungo, em contato com o inseto germinam e secretam enzimas que degradam a cutícula do hospedeiro, penetrando no corpo do inseto. Estando em seu interior, o fungo produz uma toxina chamada Beauvericina que diminui as defesa imunológica do inseto. Após a morte do hospedeiro, um antibiótico (oosporeína) é produzido, favorecendo a competição do fungo com bactérias do intestino do inseto.

UTILIZAÇÃO DIRECIONADA DOS MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS:

A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Finalmente, programas de melhoramento têm sido conduzidos e neles procura-se associar variedades de plantas melhoradas com presença de microrganismos endofíticos que atuem eficientemente no controle de pestes, mas que não prejudiquem o gado que vai se alimentar dessas plantas.

Talvez o primeiro trabalho direcionado à introdução de um gene por tecnologia do DNA recombinante em um microrganismo endofítico visando ao controle de insetos foi descrito por Fahey, em 1988. Como membro da equipe de uma empresa de biotecnologia, a Crop Genetics Internacional, ele descreve os passos para construir e utilizar uma bactéria, a Clavibacter xyli subsp. Cynodontis, para obtenção de um produto comercial que foi chamado de “Incide” (composto pelos termos “in”= dentro e “cide”= matar). Essa bactéria recebeu um gene de outra bactéria, o Bacillus Thuringiensis, produtor de toxinas ativas contra insetos, especialmente lepidópteros e coleópteros. Dessa maneira, a bactéria modificada geneticamente produz toxina. Introduzida na planta hospedeira, ela atua protegendo a planta contra o ataque de insetos suscetíveis a essa toxina. O autor cita várias vantagens do processo de inoculação dessa bactéria em plantas de milho para torna-las resistentes aos insetos, tais como: a) para ser usado, o produto requer uma única aplicação em sementes ou aspersão em plantas jovens; b) o produto não requer inoculação de doses elevadas de bactérias, pois elas se multiplicam após a aplicação; c) a bactéria modificada geneticamente fica restrita e mantida dentro da planta, não havendo, portanto, disseminação do microrganismo engenheirado; d) o processo não produz resíduos tóxicos; e) este e outros produtos semelhantes requerem um tempo menor para seu desenvolvimento tecnológico, pois é mais fácil modificar um microrganismo do que uma planta; f) o microrganismo engenheirado não é transmitido via semente, de modo que fica contido na planta e, do ponto de vista de uma empresa de biotecnologia, ele tem que ser adquirido e inoculado em novas sementes usadas em plantios; g) o processo tem ampla aplicabilidade, pois pode ser usado para diferentes espécies de plantas; h) a multiplicação da bactéria no interior da planta é alta, pois foram detectadas até 10 8 bactérias por grama da planta inoculada.

PRODUTOS COMERCIAIS CONTENDO MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS

A importância dos endófitos na produtividade tem aumentado substancialmente, pois estes microrganismos possibilitam, como já discutido anteriormente, o aumento da produtividade e da resistência a patógenos e pragas. Neste contexto, a empresa Neozelandesa AGRICOM foi a primeira companhia de sementes do mundo com experiência em produzir sementes de centeio para pastagens com fungos endofíticos de interesse. Este produto denominado de Endophyte – Endosafe tem a vantagem de trazer os benefícios da interação endófitos-plantas, sem aumentar a toxicidade para o gado que se alimenta nestas pastagens.

Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico, conhecido mundialmente no controle de inúmeras pragas de interesse agrícola. Este fungo tem sido disponibilizado comercialmente na forma de inseticida microbiano desde que foi possível a sua produção e formulação em larga escala, além de linhagens resistentes à exposição a Luz Ultra Violeta e extremos de temperatura e umidade. Atualmente, existem vários produtos comerciais com B. bassiana, incluindo Naturalis and Mycotrol. Em estudos em lowa (EUA), após aplicações em plantações de milho de formulações granulares de esporos deste fungo, observa-se colonização interna, persistência durante o desenvolvimento da planta hospedeira e significativa redução de infecção pela broca do colmo.

Segundo Nowak (1988) a cocultura de explantes de tecidos vegetais com bactérias leva a alterações metabólicas nestes tecidos, as quais aumentam a tolerância da planta a estresses bióticos e abióticos, possibilitando a utilização desta tecnologia em micropropagação comercial. Dessa forma, o desenvolvimento de mudas com endófitos de interesse pode ser a melhor estratégia para a liberação de plantas com maior resistência a doenças e pragas, bem como a melhor forma de comercialização destes microrganismos.

BIBLIOGRAFIAS CONSULTADAS:

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